El complejo de adhesión ciliar apical se establece en el pie basal de los cilios móviles y depende de la red de microtúbulos.

Scientific Reports volumen 12, número de artículo: 19028 (2022) Citar este artículo

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El complejo de adhesión ciliar (CA) se forma en estrecha asociación con los cuerpos basales de los cilios durante las primeras etapas de la ciliogénesis y es responsable de mediar interacciones complejas con las redes de actina de las células multiciliadas (MCC). Sin embargo, no se comprende bien su localización precisa con respecto a las estructuras accesorias del cuerpo basal y las interacciones que conducen a su establecimiento en los CCM. Aquí, estudiamos la distribución de las proteínas CA utilizando imágenes de superresolución y posibles interacciones con la red de microtúbulos. Los resultados de este estudio revelan que el complejo CA apical se forma en el extremo distal de la base del pie y depende de los microtúbulos. Nuestros datos también plantean la posibilidad de que las CA puedan tener funciones adicionales en la regulación de la organización de la red de microtúbulos de MCC.

Los cilios son protuberancias basadas en microtúbulos y se clasifican en cilios primarios y móviles que difieren en estructura y función1, 2. La mayoría de las células desarrollan un cilio primario único, no móvil, para detectar y transducir señales mecánicas y químicas. Los cilios móviles, por otro lado, baten de manera coordinada y polarizada para generar un flujo de fluido. Por ejemplo, las células multiciliadas (CCM) contienen cientos de cilios móviles que impulsan el flujo de líquido cefalorraquídeo en el cerebro y el transporte de ovocitos a lo largo del oviducto y son necesarias en el tracto respiratorio para eliminar la mucosidad que atrapa las partículas inhaladas y los patógenos. Por lo tanto, los defectos del flujo de líquido generado por los cilios dan como resultado un mayor riesgo de hidrocefalia e infertilidad femenina, infecciones respiratorias crónicas recurrentes y conducen a enfermedades como la discinesia ciliar primaria (DPC)3,4,5.

Los cilios se ensamblan a partir de cuerpos basales (BB), que son estructuras basadas en microtúbulos (MT) nueve veces simétricas. En los MCC, los BB están polarizados con los pies basales proyectándose hacia la dirección del flujo ciliar. La pérdida del pie basal provoca desorientación ciliar6. El pie basal funciona como un centro organizador de MT y sus proteínas están organizadas en tres regiones estructurales: la región I conecta el pie basal con los tripletes de microtúbulos del cuerpo basal y probablemente proporciona soporte mecánico durante la carrera efectiva6, 7; la región II o región de andamiaje está formada por proteínas que sirven en el ensamblaje de la base del pie, como ODF26, 8, 9, Ninein10, galactin-37, CEP1911, CEP12812, centriolin13 y CC2D2A14; la región III o región de anclaje de microtúbulos corresponde a la capa basal del pie que está compuesta por un complejo proteico que ancla o nuclea los microtúbulos. En concreto, en los cilios móviles, la tapa contiene entre otras proteínas NEDD1 y γ-tubulina que desarrollan el complejo γTuRC, necesario para la nucleación de los microtúbulos15. CEP170 es una proteína de la cubierta basal del pie necesaria para conectar los cuerpos basales a la red de microtúbulos16, 17. Además, tanto la tubulina z como la ε se localizan en la cubierta basal del pie en los CCM18. Curiosamente, el agotamiento de la z-tubulina no interrumpe la conexión de la red MT con el pie basal, pero perturba el ensamblaje de las redes de actina apicales y subapicales, lo que sugiere que el pie basal media las interacciones del cuerpo basal con el citoesqueleto de actina18.

La epidermis embrionaria de Xenopus laevis tiene una variedad de MCC que proporcionan un modelo ideal para estudiar el desarrollo y la función de los cilios. Nuestro trabajo anterior utilizando Xenopus laevis condujo al descubrimiento de una nueva estructura ciliar, denominada adherencias ciliares (CA)19. Los CA son complejos multiproteicos que se asocian con los cuerpos basales de los cilios y participan en las interacciones entre los cuerpos basales y el citoesqueleto de actina durante la diferenciación de MCC, así como en los MCC maduros. Se identificaron cuatro proteínas miembros del complejo CA: FAK, Paxillin, Vinculin y Talin; todos ellos son miembros bien caracterizados del complejo multiproteico de Adhesión Focal (FA). Los CA se forman en dos regiones distintas subapicalmente al final de la raicilla estriada y apicalmente adyacentes a los cuerpos basales; sin embargo, su posicionamiento preciso en relación con las estructuras accesorias del cuerpo basal permanece inexplorado. En el presente estudio, realizamos un análisis de localización más detallado de las proteínas CA utilizando microscopía de superresolución para aumentar la resolución de las imágenes y mejorar la precisión de la localización. La posición subciliar de CA se determinó en referencia a los marcadores proximales y distales de la base del pie. Por lo tanto, identificamos a los miembros de CA como proteínas basales del pie, lo que ayudará a futuras investigaciones sobre el papel de los componentes basales del pie en la biología de los cilios.

Según nuestras observaciones anteriores, la señal de CA se concentra adyacente a los cuerpos basales y opuesta a las raicillas, aproximadamente en el área donde se forma el pie basal y en un sitio donde el análisis de microscopía electrónica identificó interacciones entre los cuerpos basales y el citoesqueleto de actina20. Dado que el análisis TEM confirmó que el pie basal interactúa directamente con los microtúbulos corticales en los MCC maduros, inicialmente analizamos la localización de la proteína CA, FAK, en relación con la red de microtúbulos apicales en los MCC epidérmicos de Xenopus. La inmunotinción completa de embriones de Xenopus con un anticuerpo contra la β-tubulina produjo una fuerte tinción de los cilios, comprometiendo nuestra capacidad para obtener imágenes de la red MT intracelular en MCC maduros. Para superar esto, se empleó una estrategia de deciliación para eliminar las señales asociadas a los cilios y facilitar la visualización de las MT intracelulares. Los embriones inyectados con GFP-FAK/RFP-Centrin se deciliaron usando cloruro de calcio (CaCl2), un agente deciliador conocido, durante 1 minuto, y se fijaron con metanol helado, que fue el único fijador probado que conservó la localización de CA apical y retuvo un patrón similar. al obtenido mediante imágenes en vivo. La fijación de componentes de CA basada en aldehídos genera artefactos con la mayor parte de la señal de las proteínas de CA concentrada en la raicilla estriada (Fig. S1). Como se muestra en la Fig. 1A, la señal de FAK se superpone con la β-tubulina, lo que indica una colocalización parcial del complejo CA con la red de microtúbulos. Para explorar la posibilidad de que el establecimiento del complejo CA pueda depender de interacciones con la red de microtúbulos apicales, se trataron embriones GFP-FAK/RFP-Centrin con 1 μΜ de nocodazol de la etapa 23-29, que previamente se ha demostrado que altera la Red organizada de microtúbulos apicales en MCC21. Curiosamente, el tratamiento con nocodazol afecta notablemente la localización CA de FAK y su asociación con los cuerpos basales (Fig. 1B). Esto sugiere que el reclutamiento de FAK en las CA depende, al menos parcialmente, de la red de microtúbulos apicales. Además, la posición de la señal FAK con respecto al BB se ve afectada en los embriones tratados con nocodazol (Fig. 1B). Esto puede indicar cambios estructurales del BF sobre el que se forman los CA o reposicionamiento del CA sobre dicha estructura.

Los CA se asocian con los microtúbulos. (A) Coexpresión de RFP-Centrin y GFP-FAK seguida de tinción con β-tubulina en MCC deciliados. GFP-FAK está parcialmente colocalizada con microtúbulos. Barras de escala, 5 µm. (B) Los embriones inyectados con RFP-Centrin y GFP-FAK se trataron con DMSO al 0,1 % o nocodazol 1 μΜ de la etapa 23 a 29. La localización de GFP-FAK CA se ve comprometida por el tratamiento con nocodazol.

Dada la proximidad de las CA a los BF y BB, decidimos mapear la posición precisa de las CA dentro de la estructura de BF. Sin embargo, todavía falta la arquitectura molecular del pie basal en los cilios móviles de Xenopus, por lo que primero utilizamos una combinación de anticuerpos y fusiones de proteínas que se han asignado al proximal (GFP-CEP128, GFP-ODF2, CEP19, GFP- Gal3) y la región distal (GFP-CEP170, mCherry z-Tubulin, mOrange γ-Tubulin) del pie basal en mamíferos para generar un mapa del pie basal de Xenopus utilizando microscopía de superresolución (Fig. 2A). Tomamos imágenes de la mayoría de las proteínas basales del pie informadas en combinación con mTagBFP2 Centrin, que sirve como marcador para los cuerpos basales y mapeamos cuantitativamente las posiciones de las proteínas en relación con el centro del cuerpo basal (Fig. 2B). El ARNm de los marcadores basales del pie junto con el ARNm de Centrin se introdujo mediante microinyecciones dirigidas en los blastómeros ventrales de embriones en estadio de 4 células. Los componentes CEP128, ODF2 y CEP19 de la región basal del pie II mostraron distancias similares desde el centro basal del cuerpo. De manera similar a los cilios primarios humanos, Gal3 reside en la región puente entre las regiones II y III, mientras que la tubulina zeta y γ son las más distantes del centro basal del cuerpo, de manera consistente con su asociación con las MT. La distribución de CEP170 muy cerca de la región III de la base del pie es consistente con su capacidad para unirse a MT22. En general, nuestros datos mostraron que la distribución de las proteínas basales del pie en Xenopus MCC es consistente con las posiciones reportadas anteriormente en los cilios móviles humanos15.

Mapeo de proteínas basales del pie en cilios móviles de Xenopus. (A) (i) Sección óptica de una célula multiciliada que expresa mTagBFP2-Centrin y GFP-CEP128. (ii) Sección óptica de una célula multiciliada que expresa mTagBFP2-Centrin y GFP-ODF2. (iii) Sección óptica de una célula multiciliada que expresa mTagBFP2-Centrina y teñida con un anticuerpo contra CEP19. (iv) Sección óptica de una célula multiciliada que expresa mTagBFP2-Centrin y GFP-Gal3. (v) Sección óptica de una célula multiciliada que expresa mTagBFP2-Centrin y mCherry z-Tubulin. (vi) Sección óptica de una célula multiciliada que expresa mTagBFP2-Centrina y mOrange γ-Tubulin. (vii) Sección óptica de una célula multiciliada que expresa mTagBFP2-Centrin y GFP-CEP170. Las barras de escala representan 5 μm. (B) Diagrama de caja de mediciones de distancia de proteínas basales del pie en MCC epidérmicos en Xenopus. CEP128, ODF2 y CEP19 están ubicados en la región II y mostraron distancias similares del cuerpo basal, Gal3 reside en la región puente entre la región II y la región III, mientras que γ-Tubulin, z-Tubulin y CEP170 están ubicados dentro de la región distal III de la base del pie.

Utilizando este mapa de superresolución como guía, a continuación examinamos la localización de CA en relación con las proteínas que han sido asignadas a la región proximal de la base del pie. El análisis de la distribución relativa de GFP-ODF2 y GFP-128 en imágenes en vivo de cuerpos basales individuales de MCC reveló que ninguno de estos marcadores basales del pie de la región II co-localizó con mKate2-FAK (Fig. 3A). Las vistas laterales y los perfiles de intensidad del recuadro ampliado muestran distintos picos de las señales fluorescentes.

FAK se localiza en el extremo distal de la base del pie. (A) (i) Sección óptica confocal de una célula multiciliada que expresa GFP-CEP128, mKate2-FAK y mTagBFP2-Centrin. Vista de gran aumento de un cuerpo basal representativo y pilas de imágenes ortogonales (x – z) de una célula multiciliada que muestran que FAK se localiza más distalmente que CEP128 con respecto al BB. (ii) Sección óptica confocal de una célula multiciliada que expresa GFP-ODF2, mKate2-FAK y mTagBFP2-Centrin. Derecha: se muestran una vista con gran aumento de un cuerpo basal representativo y pilas de imágenes ortogonales (x-z) de una célula multiciliada. (iii) Tinción por inmunofluorescencia de CEP19 endógeno en RFP-Centrin / GFP-FAK que expresan células multiciliadas. FAK se localiza más distalmente que CEP19 con respecto al BB. (iv) Sección óptica de una célula multiciliada que expresa GFP-Gal3, mKate2-FAK y mTagBFP2-Centrin. Vista superior y proyección ortogonal (x – z) que muestra que FAK está localizada más distalmente que el marcador de la región puente Gal3 con respecto al BB. Las barras de escala representan 5 μm. (B) (i) Sección óptica representativa de una célula multiciliada que expresa GFP-FAK, mOrange γ-Tubulin y mTagBFP2-Centrin. FAK se colocaliza parcialmente con γ-tubulina. Se muestran la vista superior y la proyección ortogonal (x – z). (ii) Sección óptica de una célula multiciliada que expresa GFP-FAK, mCherry z-Tubulin y mTagBFP2-Centrin. La vista superior y la proyección ortogonal (x – z) muestran que FAK se localiza parcialmente con z-Tubulin. (iii) Sección óptica representativa de una célula multiciliada que expresa GFP-CEP170 y mKate2-FAK. Un mayor aumento de la vista superior de un solo cuerpo basal y una proyección ortogonal (x – z) muestran que FAK co-localiza con CEP170. Las barras de escala representan 5 μm. Gráfico del coeficiente de correlación de Pearson que representa la colocalización de FAK con z-tubulina, γ-tubulina y CEP170. Los valores más altos indican una colocalización más fuerte entre FAK y CEP170. (C) Célula multiciliada que expresa GFP-CEP170 y mKate2-FAK antes y después del fotoblanqueo del aceptor. La cuantificación de la intensidad de fluorescencia del aceptor (mKate2) y del donante (GFP) después del fotoblanqueo muestra que se está produciendo FRET entre GFP y mKate2, lo que confirma la superposición espacial entre las dos proteínas y aumenta la posibilidad de que FAK interactúe con CEP170. Se llevaron a cabo experimentos de control con GFP-Centrin como donante y mKate2-FAK como aceptor, lo que indica la ausencia de una interacción directa entre centrin y FAK. Las barras de escala representan 10 μm.

Además, el análisis de distribución de FAK con respecto a centrina y CEP19 sugirió una localización más distal de las CA (Fig. 3A). Por lo tanto, a continuación estudiamos la localización de FAK en relación con Galectina-3, que ha demostrado tener una distribución amplia, en los cilios primarios, extendiéndose hacia la región puente entre las regiones II y III del pie basal15. Sin embargo, los perfiles de intensidad de fluorescencia mostraron que FAK se encuentra más distalmente al marcador de la región puente. En conjunto, estos datos sugieren que FAK se localiza más distalmente que los marcadores conocidos de las regiones proximales de la base del pie, lo que sugiere que el complejo CA puede formarse en la región distal III.

A continuación, investigamos si el complejo CA se establece en el extremo distal de la base del pie en las células multiciliadas de la epidermis del renacuajo. Analizamos la distribución de FAK en relación con el nucleador de microtúbulos γ-tubulina, que se sabe que se localiza en la tapa basal del pie en los MCC7, 23. Se encontró que la expresión de GFP-FAK en los MCC se superpone parcialmente con la γ-tubulina, de acuerdo con nuestro estudio anterior. Los datos sugieren que las proteínas miembros de CA se localizan en las proximidades de la tapa basal del pie (Fig. 3B). A continuación, analizamos la distribución de FAK en relación con Centrin y z-Tubulin, otro componente de la capa basal del pie18. De manera similar, los perfiles de intensidad de fluorescencia revelan una colocalización parcial de z-tubulina y FAK, lo que confirma que las CA se forman muy cerca de la capa basal del pie.

Para investigar esto más a fondo, coexpresamos mKate2-FAK y GFP-CEP170, una proteína ubicada en la región III16. Como se muestra, la señal de FAK se superpone con la señal de CEP170 (Fig. 3B). De hecho, las dos señales muestran un coeficiente de colocalización más alto en comparación con cualquier otro marcador probado. Los datos anteriores muestran que las CA se forman en la región III del pie basal y la clara colocalización entre FAK y CEP170 plantea la posibilidad de que los dos interactúen. Para examinar esta posibilidad, coexpresamos GFP-CEP170 (donante) con mKate2-FAK (aceptor) y llevamos a cabo experimentos de fotoblanqueo del aceptor para examinar la posibilidad de transferencia de energía por resonancia de fluorescencia intermolecular (FRET). Estos experimentos muestran que FRET se produce entre GFP-CEP170 y mKate2-FAK en MCC (Fig. 3C). Los experimentos de control que utilizan centrin GFP como donante y mKate2-FAK como aceptor no detectan FRET, como se esperaba, y muestran que FAK no interactúa con centrin. Por lo tanto, concluimos que el complejo CA se establece en el extremo distal de la base del pie en los MCC y puede depender de una interacción entre FAK y CEP170.

Los datos de localización plantearon la posibilidad de que las CA pudieran participar en la formación del pie basal en Xenopus MCC. Para abordar esta posibilidad, inyectamos embriones de Xenopus con un morfolino bloqueador de la traducción (MO) previamente caracterizado para anular la expresión de FAK en células multiciliadas19, 24, 25 (Fig. S2). Examinamos la localización de los marcadores basales del pie mediante la coexpresación de z-tubulina y galectina-3 marcadas con fluorescencia, después de que se establece la orientación basal del cuerpo (etapas 30 a 35). Como se muestra, el pie basal está establecido en los morfantes FAK, ya que el componente z-tubulina de la tapa del pie basal y la proteína del pie basal proximal Galectina-3 todavía estaban presentes (Fig. 4A). Curiosamente, la distancia entre los marcadores basales proximales y distales del pie aumentó en los morfantes FAK en comparación con los controles, lo que sugiere que la estructura basal del pie puede verse afectada, lo que lleva a estructuras más largas (Fig. 4B).

El agotamiento de FAK induce defectos en la red de microtúbulos de MCC. (A) Control que expresa GFP-Galectina 3 y mCherry z-Tubulin y células multiciliadas morfantes FAK. Barras de escala, 5 µm. (B) Cuantificación de la distancia entre GFP-Galectina 3 y z-tubulina que muestra estructuras basales del pie más largas en morfantes FAK. Las barras de error representan la media ± SEM. (C) La red de microtúbulos en el control y las células multiciliadas inyectadas con morfolino FAK se tiñeron con un anticuerpo contra la β-tubulina. Las imágenes confocales de embriones en etapa 35 muestran defectos en la red de microtúbulos en morfantes FAK. Las barras de escala representan 10 μm. (D) Variación de intensidad espacial de la señal de fluorescencia de β-tubulina en control y FAK MO MCC. El análisis se realizó midiendo la intensidad de la fluorescencia en múltiples ROI dentro de MCC individuales (se usaron 3 embriones de control y 3 embriones FAK MO para las mediciones). Las barras de error representan la media ± SEM.

La colocalización parcial de las CA con la tapa basal del pie, que actúa como un centro organizador de microtúbulos (MTOC) que participa en la nucleación y/o estabilización de los microtúbulos, plantea la posibilidad de que las CA puedan estar involucradas en estos procesos. Por lo tanto, también analizamos la red de microtúbulos apicales en morfantes FAK. El agotamiento de FAK en los MCC conduce a una alteración grave de la red de microtúbulos apicales (Fig. 4C, D). Sin embargo, no podemos excluir la posibilidad de que esto sea un efecto secundario de los defectos de acoplamiento del cuerpo basal observados en los morfantes FAK.

En general, los datos anteriores sugieren que la regulación negativa de FAK afecta la estructura del pie basal dados los cambios en la relación espacial de Gal3 y z-tubulina y provoca defectos severos de la red de microtúbulos apicales que, sin embargo, podrían ser secundarios a la falla de los cuerpos basales para acoplarse. .

Los miembros de CA FAK y paxillin mostraron una colocalización significativa pero no perfecta (Fig. S3A). La estrecha relación espacial entre las CA y CEP170, así como la posible interacción entre los miembros de CA y esta proteína, plantea la posibilidad de que CEP170 pueda estar mediando interacciones entre las proteínas BB y CA. Dado que FAK está presente durante la migración del cuerpo basal19, examinamos la relación temporal entre FAK, Paxillin y CEP170 con respecto a su asociación con los BB. Como se muestra en la Fig. 5A, CEP170 está asociado con los cuerpos basales, marcados por la centrina mTag-BFP2, desde la etapa 16, durante la intercalación de células ciliadas. En esta etapa, cuando comienza la intercalación radial de MCC, aunque CEP170 estaba claramente asociado con los cuerpos basales, FAK solo se detectó débilmente (Fig. 5B). En la etapa 18, cuando los centriolos comienzan a migrar hacia la superficie apical, FAK se colocaliza con CEP170 y está estrechamente asociado con los cuerpos basales. En la etapa 20, cuando las células comienzan a sufrir ciliogénesis, FAK era visible cerca de los cuerpos basales maduros acoplados en la superficie apical. Continuamos comparando la cinética de asociación temporal de FAK con la de paxilina (Fig. 5C). El análisis del coeficiente de correlación de Pearson muestra que, a diferencia de FAK, la paxilina está claramente asociada con los BB en los puntos temporales más tempranos en la etapa 16, similar a CEP170 (Fig. 5D). Esto sugiere que la paxilina puede reclutarse en los BB a través de CEP170 y posteriormente recluta FAK para formar el complejo CA de acuerdo con datos anteriores que muestran que FAK depende de su interacción con paxilina para la localización de CA. Continuamos explorando la posibilidad de una interacción directa entre CEP170 y paxillin mediante experimentos de inmunoprecipitación utilizando GFP-CEP170 expresado exógenamente y mScarlet-Paxillin en células T HEK 293. Como se muestra en la figura S3B, existe una interacción clara entre las dos proteínas, lo que brinda apoyo adicional para el papel de CEP170 en el establecimiento de CA. El trabajo futuro se centrará en el papel de CEP170 en el establecimiento del complejo CA apical.

Asociación jerárquica de CEP170 y FAK con cuerpos basales. (A) Las imágenes confocales de células ciliadas intercaladas de embriones de Xenopus en etapa 17 que coexpresan mTag-BFP2-Centrin y GFP-CEP170 muestran que CEP170 está asociado con cuerpos basales durante las primeras etapas del desarrollo de MCC. Las barras de escala representan 5 μm. (B) Células ciliadas intercaladas de embriones de Xenopus que coexpresan mTag-BFP2-Centrin, mKate2-FAK y GFP-CEP170. Se tomaron imágenes de los embriones en las etapas indicadas. CEP170 se asocia con los cuerpos basales en la etapa 16, mientras que una clara asociación de FAK se vuelve detectable en la etapa 18. Las barras de escala representan 5 μm. (C) Células ciliadas intercaladas de embriones de Xenopus que coexpresan mTag-BFP2-Centrin, mKate2-FAK y GFP-Paxillin que muestran que, a diferencia de FAK, Paxillin está claramente asociada con los cuerpos basales en la etapa 16. Se tomaron imágenes de los embriones en las etapas indicadas. Las barras de escala representan 5 μm. (D) Gráficos del coeficiente de correlación de Pearson que representan la colocalización de mKate2-FAK, GFP-CEP170 y GFP-Paxillin con mTagBFP2-Centrin en la etapa 16. Paxillin y CEP170 muestran un coeficiente de colocalización más alto con centrin en comparación con FAK. Las barras de error representan la media ± SEM.

Anteriormente identificamos un papel novedoso de FAK, como miembro de complejos de CA en MCC epidérmicos de Xenopus19. La pérdida de FAK en estas células conduce a una alteración de la ciliogénesis debido a una asociación defectuosa de los cuerpos basales con el citoesqueleto de actina. En los MCC, las CA se ubican posteriores a los cuerpos basales, con respecto al eje AP del renacuajo, donde reside el pie basal, pero se desconoce su localización precisa. Aprovechando la microscopía de superresolución, pudimos comparar la localización de FAK con la de los marcadores BF y definir la región en la que se forman las CA apicales con alta resolución espacial. Encontramos que FAK se localiza cerca de la base del pie (Fig. 6). Más específicamente, encontramos que FAK y la proteína CEP170 asociada a la región III se superponen espacialmente y muestran un coeficiente de colocalización muy alto. Esto muestra que los CA apicales se forman en la región III de la base del pie.

Localización de CA en la región distal de la base del pie. Representación en caricatura de la localización de CA en la región distal de la base del pie. Los componentes basales del pie están organizados en regiones espacialmente distintas con diferentes funciones (región I, anclaje del cuerpo basal; región II, andamiaje; región III, anclaje MT).

La localización de FAK en el complejo CA depende en gran medida del dominio FAT y su interacción con Paxillin, de manera similar a la localización de FAK en las FA. De hecho, el mutante FAK I936E/I998E que no se une a paxilina no logra ser reclutado en las CA y no logra rescatar los morfantes FAK, lo que demuestra que la interacción con paxilina es necesaria tanto para la localización como para la función26. De acuerdo con estos resultados, observamos que Paxillin parece estar asociado con cuerpos basales en células multiciliadas antes que FAK. Curiosamente, CEP170 también está asociado con los BB en etapas tempranas similares a la paxilina, lo que plantea la posibilidad de que CEP170 reclute paxilina en la base del pie y posteriormente reclute FAK para formar el complejo CA.

La pérdida de la base del pie en ratones provoca manifestaciones respiratorias indicativas de PCD. En los CCM traqueales, la pérdida del pie basal provoca la alteración de la red apical de los microtúbulos y la desorientación de los cuerpos basales6. La localización de FAK en la base del pie sugiere que las CA podrían estar involucradas en el establecimiento o mantenimiento de la red de microtúbulos apicales. Los morfantes FAK muestran pies basales más largos y una red de microtúbulos alterada (Fig. 3), lo que sugiere que los CA pueden desempeñar un papel en la regulación de la estructura BF. A pesar del papel fundamental del pie basal en la función de las células multiciliadas, su organización molecular en Xenopus aún no se ha dilucidado. Además de definir la localización precisa y analizar el papel de la proteína CA FAK, también proporcionamos un mapa molecular de los componentes basales del pie conocidos (ODF2, CEP128, Galectina 3, CEP19, Ninein, CEP170, z-Tubulin y γ-Tubulin). en Xenopus motile cilios. Utilizando imágenes de superresolución, demostramos que el pie basal en los CCM de Xenopus tiene un alto nivel de similitud con el pie basal de las células multiciliadas de las vías respiratorias humanas15. Este alto nivel de conservación entre el pie basal humano y Xenopus reafirma a Xenopus como un sistema modelo valioso para el estudio de los cilios móviles.

Se ovularon hembras adultas de Xenopus laevis mediante inyección de gonadotropina coriónica humana. Los óvulos se fertilizaron in vitro, se quitaron la gelatina en cisteína al 1,8% (pH 7,8) y los embriones se mantuvieron en timbres modificados de Marc (MMR) 0,1 × y se organizaron según Nieuwkoop y Faber. Las microinyecciones se realizaron en Ficoll al 4% en 0,33 × MMR en los blastómeros ventrales de embriones en etapa de 4 u 8 células para apuntar a la epidermis. Para los experimentos de MO, inyectamos 12 ng de morfolino FAK por blastómero (en embriones en etapa de 8 células). Para obtener imágenes en vivo, los embriones se anestesiaron con benzocaína al 0,01% en 0,1 × MMR y se inmovilizaron en pocillos de grasa de silicona en portaobjetos de vidrio.

Los adultos de Xenopus laevis se mantienen de acuerdo con las directrices de la UE y las directrices de los Servicios Veterinarios del Ministerio de Agricultura, Recursos Naturales y Medio Ambiente del gobierno de Chipre. Xenopus laevis se encuentra en nuestras instalaciones autorizadas (número de licencia CY.EXP.102 de la Universidad de Chipre). Todos los experimentos y protocolos experimentales fueron aprobados por el Comité Nacional para la Protección de Animales Utilizados con Fines Científicos de la República de Chipre con la licencia (CY/EXP/PR.L05/2022). Los experimentos se realizaron de conformidad con las directrices ARRIVE (https://arriveguidelines.org).

Los plásmidos se transcribieron en ARNm utilizando el kit mMessage mMachine SP6 o T7 (Invitrogen) y se utilizaron para microinyecciones. La secuencia de FAK MO utilizada en nuestros experimentos es TTGGGTCCAGGTAAGCCGCAGCCA19, 26.

Se permitió que los embriones se desarrollaran hasta la etapa apropiada y luego se tomaron imágenes en vivo o se fijaron en metanol a -20 °C durante 2 h y se rehidrataron gradualmente con 75% de metanol-25% de MEMFA (10X: MOPS 1 M, EGTA 20 mM, MgSO4 10 mM). , 38% Formaldehído), 50% metanol-50% MEMFA, 25% metanol-75% MEMFA y 100% MEMFA durante 10 min cada uno. Luego, los embriones se permeabilizaron en PBDT (1 x PBS + Triton X-100 al 0,5 % + DMSO al 1 %) durante varias horas a temperatura ambiente y se bloquearon en PBDT + suero de burro al 10 % durante 1 h a temperatura ambiente. Luego se agregaron anticuerpos primarios (en solución de bloque). Los anticuerpos primarios utilizados fueron: β-tubulina (Hybridoma), γ-tubulina (Abcam) y CEP19 (Proteintech). Los embriones se incubaron en la solución de anticuerpos durante la noche a 4 °C. Al día siguiente, los embriones se lavaron en PBDT y luego se incubaron en anticuerpos secundarios diluidos en la solución de bloqueo a temperatura ambiente durante 1 h. Las imágenes se realizaron en un microscopio confocal de barrido láser Zeiss LSM 900 con sistema de imágenes Airyscan. El procesamiento de imágenes y el análisis de colocalización se realizaron utilizando el software Zeiss ZEN 2.3.

Los experimentos FRET se realizaron utilizando un microscopio confocal de barrido láser (Zeiss LSM 710) con una lente objetivo Plan-Apochroma 63 × /1.40 Oil DIC M27 (Zeiss). Se utilizó un láser de 543 nm para el fotoblanqueo del aceptor (mKate-FAK) dentro de una región de interés (ROI). Se adquirió un cuadro como control previo al blanqueo y la ROI se blanqueó dentro de un cuadro. Se utilizó el software Zeiss Zen 2010 para el análisis FRET.

Las células T HEK 293 (ATTC) se mantuvieron en DMEM suplementado con FBS al 10%. Las transfecciones se realizaron utilizando Lipofectamine 2000 (Invitrogen) según el protocolo del fabricante.

Para la inmunoprecipitación, se cotransfectaron células T HEK 293 con GFP-CEP170 y mScarlet Paxillin. 24 h después de la transfección, las células se lisaron con tampón de lisis helado (Tris-HCl 50 mm, pH 7,5, NaCl 150 mm, EDTA 1 mm, NP-40 al 1%) suplementado con inhibidores de proteasa y fosfatasa. Los lisados ​​​​celulares se incubaron con perlas trampa GFP (Chromotek) y la mezcla se incubó durante 2 h a 4 ° C con agitación continua. Las perlas se recogieron mediante centrifugación a 2000 xg, se lavaron con tampón de lisis y se resuspendieron en tampón Laemmli. Las muestras se utilizaron para análisis de transferencia Western.

Las proteínas se procesaron en geles de poliacrilamida-SDS al 8% y se transfirieron a membranas de nitrocelulosa. Las transferencias se bloquearon en leche al 5% en PBST (1 x PBS y Tween 20 al 0,1%) y luego se incubaron con los anticuerpos primarios a 4 °C. Los anticuerpos primarios utilizados fueron: GFP (1:1000, Novus), FAK (1:1000 Proteintech), paxilina (1:5000 BD Biosciences) y GAPDH (1:3000, SantaCruz). Las membranas se cortaron antes de la incubación del anticuerpo. La visualización se realizó utilizando anticuerpos conjugados con HRP (Santa Cruz) después de 1 h de incubación a temperatura ambiente, y se detectó una señal utilizando el sistema de imágenes ChemiDoc (Bio-Rad). Las transferencias originales se muestran en el archivo de información complementaria.

Los conjuntos de datos utilizados y/o analizados durante el estudio actual están disponibles a pedido del autor correspondiente.

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Agradecemos a la Dra. Lotte Bang Pedersen por proporcionarnos amablemente el plásmido GFP-CEP128.

Este trabajo fue financiado por la Fundación para la Promoción de la Investigación (EXCELLENCE/1216/1236 y EXCELLENCE/0918/0227).

Departamento de Ciencias Biológicas, Universidad de Chipre, PO Box 20537, 2109, Nicosia, Chipre

María Chatzifrangkeskou y París A. Skourides

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MC llevó a cabo los experimentos y el análisis de datos. MC y PAS escribieron el manuscrito.

Correspondencia a París A. Skourides.

Los autores declaran no tener conflictos de intereses.

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Reimpresiones y permisos

Chatzifrangkeskou, M., Skourides, PA El complejo de adhesión ciliar apical se establece en el pie basal de los cilios móviles y depende de la red de microtúbulos. Informe científico 12, 19028 (2022). https://doi.org/10.1038/s41598-022-22871-0

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Recibido: 27 de junio de 2022

Aceptado: 20 de octubre de 2022

Publicado: 08 de noviembre de 2022

DOI: https://doi.org/10.1038/s41598-022-22871-0

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